Νέα 2012

ΦΥΛΑΞΗ ΣΕ ΚΡΥΟΑΣΚΟΥΣ Η ΚΡΥΟΦΙΑΛΙΔΙΑ

Υπάρχουν δύο τρόποι αποθήκευσης των βλαστικών κυττάρων. Η αποθήκευση σε ατμούς υγρού αζώτου, ή μέσα στο υγρό άζωτο. Επίσης υπάρχουν δύο συσκευασίες αποθήκευσης, οι κρυοασκοί και τα κρυοφιαλίδια. Το υλικό κατασκευής και των δύο είναι όμοιο, ανθεκτικό στη θερμοκρασία των -196⁰C. Οι δύο συσκευασίες διαφέρουν ως προς το μέγεθος και το σχήμα.

Η Biohellenika έχει όλες τις κατάλληλες υποδομές σε εξοπλισμό και σε επιστημονικό προσωπικό για  να κάνει και τους δύο τρόπους φύλαξης, σε κρυοασκό ή κρυοφιαλίδιο.

Η Biohellenika είναι η μοναδική εταιρεία που παρέχει στους γονείς τη δυνατότητα να επιλέξουν τον τρόπο φύλαξης είτε σε κρυοασκό είτε σε κρυοφιαλίδιο, μετά από υπεύθυνη ενημέρωση.

Κρυοσυντήρηση σε Κρυοασκούς	Κρυοσυντήρηση σε Κρυοφιαλίδια
Απαιτείται κατά τον τοκετό να συλλεγεί μεγάλος όγκος αίματος, διαφορετικά  το δείγμα απορρίπτεται εξ αρχής. Μαζί με τα βλαστοκύτταρα που φυλάσσονται στον κρυοασκό παραμένει και μεγάλη ποσότητα ερυθρών αιμοσφαιρίων, λόγω αδυναμίας του συστήματος να διαχωρίσει πλήρως τα βλαστοκύτταρα.	Η φύλαξη σε κρυοφιαλίδια γίνεται ανεξάρτητα του όγκου του ομφαλοπλακουντιακού αίματος που συλλέγεται κατά τον τοκετό. Όλες οι συλλογές μικρού ή μεγάλου αρχικού όγκου μπορούν να κρυοσυντηρηθούν. Στα κρυοφιαλίδια, λόγω λεπτομερέστερου διαχωρισμού, κρυοσυντηρούνται μόνο βλαστοκύτταρα και όχι ερυθρά αιμοσφαίρια. Ο αριθμός των βλαστοκυττάρων σε ένα δείγμα δεν είναι ανάλογος του αρχικού όγκου συλλογής.
Τα δείγματα ελέγχονται ως προς τον όγκο του ομφαλοπλακουντιακού αίματος με κριτήριο αποδοχής τα 60ml. Στην περίπτω­ση που θα κριθεί κατάλλη­λο, ακολουθεί επεξεργα­σία με σκοπό τη μείωση του τελικού όγκου, προκειμένου να καταψυ­χθεί, διατηρώντας τα αρχέγονα κύτταρα. Αν ο αρχικός όγκος είναι μικρότερος των 60ml το αίμα απορρίπτεται εξ αρχής ως ακατάλληλο, λόγω κινδύνου ρήξης του ασκού κατά την απόψυξη.	Όλα τα δείγματα του ομφαλοπλακουντιακού αίματος ελέγχονται ως προς την ποσότητα κυττάρων και την ποιότητα τους και μπορούν να κρυοσυντηρηθούν.  Σε περίπτωση που η τελική ποσότητα βλαστοκυττάρων είναι μικρή, το δείγμα φυλάσσεται αποκλειστικά για την οικογένεια χωρίς χρέωση.
Η επεξεργασία γίνεται σε ένα προγραμματισμένο μηχάνημα που ακολουθεί ακριβώς την ίδια διαδικασία ανεξαρτήτως μικρού ή μεγάλου αρχικού όγκου και ουσιαστικά γίνεται μείωση όγκου λόγω αφαίρεσης των υγρών στοιχείων του αίματος και μερικής απομάκρυνσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων.	Η επεξεργασία γίνεται σε ειδικά εργαστήρια από εξειδικευμένο επιστημονικό προσωπικό. Η μεγάλη ελάττωση του όγκου αίματος που γίνεται κατά τη φύλαξη σε κρυοφιαλίδια οφείλετε στην πλήρη απομάκρυνση των ερυθρών αιμοσφαιρίων τα οποία δεν έχουν ιδιότητες βλαστικών κυττάρων.
Τα αυτόματα μηχανήματα για το διαχωρισμό των κυττάρων που χρησιμοποιούνται από διάφορες εταιρείες ιδιωτικές και τη δημόσια τράπεζα στην Ελλάδα διατηρούν στον τελικό όγκο της κατάψυξης το 74% του αρχικού αριθμού των βλαστικών κυττάρων.	Το πρωτόκολλο της Biohellenika, το οποίο δημοσιεύτηκε στο διεθνές περιοδικό Cytotherapy 4:1-6, 2007, διατηρεί στον τελικό όγκο της κατάψυξης το 98% του αρχικού αριθμού των βλαστοκυττάρων.
Δεν απαιτείται ειδικός εργαστηριακός εξοπλισμός κατά τα πρότυπα GMP, η εργαστηριακή διαδικασία προσφέρεται μαζί με τον εξοπλισμό και δεν υπάρχει η δυνατότητα διαφοροποίησης του πρωτοκόλλου κατά την επεξεργασία των δειγμάτων.	Η φύλαξη σε κρυοφιαλίδια απαιτεί ειδικό εργαστηριακό εξοπλισμό κατά τα πρότυπα GMP, εξειδικευμένη εργαστηριακή μέθοδο και προσωπικό, καθώς και χωριστή επεξεργασία κάθε δείγματος.
Ο κρυοασκός είναι ένας και το δείγμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο μια φορά. Για να γίνει φύλαξη σε δύο κρυοασκούς πρέπει να διαχωρίσει  ο μαιευτήρας το ομφαλοπλακουντιακό αίμα εξ αρχής σε δυο ασκούς αίματος.	Τα κρυοφιαλίδια είναι από 3 έως 8 (3 από το ομφαλοπλακουντιακό αίμα, 3 από την αποστράγγιση του πλακούντα, 2 από τον ιστό του ομφαλίου λώρου) και συνεπώς μπορούν να χρησιμοποιηθούν για περισσότερες από μια φορά. Οι μελλοντικές εφαρμογές της Ιατρικής απαιτούν τη δυνατότητα πολλαπλών χρήσεων και τμηματική φύλαξη σε κρυοφιαλίδια.
Το δείγμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο από άτομα με την ίδια ομάδα αίματος, ακόμα και μέσα στην οικογένεια, επειδή παραμένουν πολλά  ερυθρά αιμοσφαίρια στον τελικό όγκο κατάψυξης.	Μπορούν να χρησιμοποιηθούν από όλη την οικογένεια ανεξαρτήτου ομάδας αίματος, αφού αφαιρούνται τα ερυθρά αιμοσφαίρια.
Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο σε αιματολογικές ασθένειες. Δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε εφαρμογές της Αναγεννητικής Ιατρικής λόγω του μεγάλου αριθμού των ερυθρών αιμοσφαιρίων που περιέχει.	Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για θεραπείες αιματολογικών ασθενειών, αυτοάνοσων νοσημάτων και σε εφαρμογές της Αναγεννητικής Ιατρικής.
Η ποσότητα της κρυοπροστατευτικής ουσίας DMSO που είναι απαραίτητη για τη σωστή κρυοσυντήρηση του δείγματος είναι μεγάλη λόγω του μεγάλου όγκου του δείγματος. Η ουσία αυτή προκαλεί παρενέργειες κατά τη διάρκεια της μεταμόσχευσης.	Η κρυοπροστατευτική ουσία που προστίθεται για ομαλή κρυοσυντήρηση είναι ελάχιστη, με αποτέλεσμα να μην παρατηρούνται ανεπιθύμητες ενέργειες κατά τη χορήγηση των βλαστοκυττάρων που φυλάσσονται σε κρυοασκούς.
Λόγω της μεγάλης ποσότητας της κρυοπροστατευτικής ουσίας DMSO μετά   την απόψυξη ακολουθούν πλύσεις του δείγματος  που οδηγούν σε σημαντική απώλεια βλαστοκυττάρων.	Στα κρυοφιαλίδια κρυοσυντηρείται καθαρός πληθυσμός βλαστοκυττάρων,  το δείγμα δεν χρειάζεται έκπλυση και είναι έτοιμο προς χορήγηση μετά την απόψυξή του.
Ο κρυοασκός παρουσιάζει ευθραυστότητα και έχει παρατηρηθεί ότι ένα ποσοστό 3,5-9,6% των κρυοασκών σπάζει κατά τη διάρκεια της απόψυξης και στο 75% η ρήξη αφορά ασκούς κρυοσυντηρημένους για διάστημα μεγαλύτερο των 2 ετών, οπότε τα δείγματα αυτά δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν. Έχει αναφερθεί μεταφορά μολυσματικού υλικού μεταξύ ρηγμένων ασκών.	Δεν έχει ποτέ μέχρι σήμερα παρατηρηθεί ρήξη των κρυοφιαλιδίων, ούτε μεταφορά μολυσματικού υλικού από το ένα στο άλλο.
Ο κρυοασκός φυλάσσεται σε ατμούς υγρού αζώτου, διότι λόγω του μεγαλύτερου μεγέθους  και  σχήματος του καθίσταται  εύθραυστος κατά την απόψυξη του δείγματος. Η μακροβιότητα των κυττάρων δεν έχει μελετηθεί και η δημόσια τράπεζα που ακολουθεί τη φύλαξη σε κρυοασκούς ανανεώνει τα δείγματα κάθε πενταετία. Η φύλαξη των ασκών στους ατμούς υγρού αζώτου υπόκειται σε μεταβολές της θερμοκρασίας, ανάλογα με το ύψος πάνω από την επιφάνεια του αζώτου και τους χειρισμούς που γίνονται καθημερινά στο δοχείο φύλαξης. Οι μακροχρόνιες μεταβολές της θερμοκρασίας φύλαξης οδηγούν σε ελάττωση της βιωσιμότητας των κυττάρων.	Τα κρυοφιαλίδια  φυλάσσονται με ασφάλεια κάτω από την επιφάνεια του υγρού αζώτου και μέχρι σήμερα δεν έχει ποτέ διαπιστωθεί αλλοίωση του τοιχώματός τους. Τα κρυοφιαλίδια εξωτερικά καλύπτονται με κρυοανθεκτική μεμβράνη, η οποία τα θωρακίζει ακόμη περισσότερο. Μακροχρόνια φύλαξη των βλαστικών κυττάρων έχει γίνει σε κρυοφιαλίδια από τον Broxmayer και συν για πρώτη φορά το 1988 και μέχρι σήμερα τα κύτταρα διατηρούν όλες τις βιολογικές τους ιδιότητες, χωρίς καμία αλλοίωση, σύμφωνα με δημοσιεύσεις των εν λόγω επιστημόνων. Η φύλαξη των κρυοφιαλιδίων μέσα στο υγρό άζωτο εξασφαλίζει σταθερή και αδιατάρακτη θερμοκρασία συντήρησης για τα κύτταρα.
Το κόστος επεξεργασίας είναι χαμηλό και η κρυοσυντήρηση σε ατμούς υγρού αζώτου είναι φτηνότερη μέθοδος καθώς πληρείται μόνο το κάτω μέρος του δοχείου.	Το κόστος επεξεργασίας είναι ψηλότερο σε σύγκριση με την επεξεργασία σε κρυοασκούς και η κρυοσυντήρηση κοστίζει πιο ακριβά γιατί χρησιμοποιείται περισσότερο άζωτο.

Η χρήση των ασκών έχει αρχίσει από το 2000 και μετά, για τις ανάγκες των δημοσίων τραπεζών, όπου οι εφαρμογές περιορίζονται στη θεραπεία ασθενειών του αιμοποιητικού συστήματος και κυρίως της λευχαιμίας.

Σήμερα ο Εθνικός Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων της Αμερικής προτείνει τον ανασχεδιασμό των ασκών κρυοκατάψυξης με ανθεκτικότερα υλικά, αλλά μέχρι τότε πιθανόν να προταθεί ελάττωση του χρόνου κρυοσυντήρησης σε ασκούς (Thyagarajan B, Berger M, Sunstad D, McKenna DH Transfusion 2008, April 16).

Η Biohellenika, αποκλειστικός εταίρος του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών, είναι η πρώτη τράπεζα βλαστοκυττάρων στην Ελλάδα που έλαβε διαπίστευση από το Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης και συνέβαλε στην ανάπτυξη των υπηρεσιών διαπίστευσης των Τραπεζών βλαστοκυττάρων στην Ελλάδα. Είναι η πρώτη και η μοναδική σήμερα τράπεζα που διαθέτοντας τις κατάλληλες υποδομές και τον εξοπλισμό πήρε άδεια λειτουργίας από το Υπουργείο Υγείας και είναι η πρώτη τράπεζα που έδωσε δύο δείγματα βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος προς μεταμόσχευση σε διαπιστευμένη Αιματολογική κλινική των ΗΠΑ.

Τα δείγματα του ομφαλοπλακουντιακού αίματος τα οποία έως σήμερα η Biohellenika χορήγησε για θεραπείες στη διαπιστευμένη από τον FACT NETCORD Αιματολογική κλινική του Πανεπιστημίου του Duke των ΗΠΑ, είχαν φυλαχτεί σε κρυοφιαλίδια. Η φύλαξη σε κρυοφιαλίδια έδωσε τη δυνατότητα στο δεύτερο παιδί με εγκεφαλική παράλυση να χρησιμοποιήσει ένα μέρος από τα κύτταρά του, διότι ήταν πολλά σε σχέση με το βάρος του,  και τα υπόλοιπα θα τα χρησιμοποιήσει σε δεύτερη φάση, όταν κριθεί αναγκαίο.

Η φύλαξη σε κρυοφιαλίδια στη Biohellenika έχει διεθνώς εγκριθεί από την Αμερικανική Ένωση Τραπεζών Αίματος (ΑΑΒΒ), η οποία κατέταξε τη Biohellenika μέσα στα τρία καλύτερα εργαστήρια στην Ευρώπη και ανανέωσε με επιτυχία τη διαπίστευση το Σεπτέμβριο του 2012. Το σύστημα φύλαξης σε κρυοφιαλίδια επίσης είναι πιστοποιημένο κατά ISO 13485.

Η Biohellenika αποτελεί σήμερα την πιο συχνή επιλογή των Ελλήνων γονέων που αποφασίζουν να φυλάξουν τα πολύτιμα βλαστοκύτταρα των παιδιών τους και κατέχει την τεχνογνωσία λήψης επιπλέον βλαστοκυττάρων με αποστράγγιση του πλακούντα, απομόνωσης θεραπευτικών βλαστοκυττάρων από διάφορους ιστούς και κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Η Biohellenika πρώτη σε αριθμό δειγμάτων και οικονομικά μεγέθη εταιρεία του κλάδου Ελλάδα συνεχίζει τη σταθερή αναπτυξιακή της πορεία με σταθερότητα και ισχυρές στρατηγικές συνεργασίες τόσο στον Ελληνικό όσο και στο διεθνή χώρο.

1. Microbial contamination of embryos and semen during long term banking in liquid nitrogen. Bielanski A, Bergeron H, Lau PC, Devenish J 2003, Cryobiology 46(2):146-52
2. Experimental evaluation of cross-contamination between cryotubes contained mouse 2-cell embryos and murine pathogens in liquid nitrogen tanks. Kyuwa S, Nishikawa T, Kaneko T, Nakagata N 2003, Exp Anim 52(1):67-70
3. Viral contamination of embryos cryopreserved in liquid nitrogen, Bielanski A, Nadin-Davis S, Sapp T, Lutze-Wallace C 2000 40(2):110-6
4. A broken cord blood bag: placing the unit in a steile zip-lock bag before thawing prevents catastrophic events. Larrea L, Sanz G, Solves P, Mirabet V, Roig R 2008. Transfusion 48(7):1282-3
5. Catastrophic failures of freezing bags for cellular therapy products: description, cause, and consequences. Khuu HM, Cowley H, David-Ocampo V, Carter CS, Kasten-Sportec C, Wayne AS, Solomon SR, Bishop MR, Childs RM, Read EJ 2002, Cytotherapy 4(6);539-49
6. Loss integrity of umbilical cord blood unit freezing bags: description and consequences. Thyagarajan B, Berger M, Sumstad D, McKenna DH 2008, Transfusion 48 (6):1138-42.
7. Addition of adipose-derived stem cells in cord blood cultures stimulates their pluripotent differentiation.Tsagias N, Kouzi-Koliakos K, Koliakos I, Kostidou E, Karagiannis V, Daniilidis A, Koliakos G 2009. Trans Proccedings 41(10): 4340-4.
8. A novel high-yield volume-reduction method for the cryopreservation of UC blood units. Koliakos G, Alamdari DH, Tsagias N, Kouzi-Koliakos K, Michaloudi E, Karagiannis V, 2007. Cytotheraphy 9 (7):654-9.
9. Cell Recovery Sufficient for Adult Transplantation by AdditionalCord Blood Collection From Placenta. N. Tsagias, K. Kouzi-Koliakos, D. Hamidi-Alamdari, V. Karagiannis, E. Kostidou, and G. Koliakos,2007. 39: 3380-3384
10. Time and temperature before processing influence the recovery of umbilical cord blood hematopoietic progenitors.Tsagias N, Kouzi-Koliakos K, Karagiannis V, Alamdari DH, Koliakos G. Transfusion. 2007 Aug;  47(8):1550-2.
11. http://www.eae.gr/new/LASCM2.pdf - Σχεδίαση Δικτύου Δημοσίων Τραπεζών Ομφαλικών Μοσχευμάτων στην Ελλάδα, σελ. 186

Κ Κουζή-Κολιάκου

Kαθηγήτρια Ιατρικής